益生菌及酸奶制品中微生物快速鑒定
發(fā)布時間:2025-08-06 閱讀次數(shù)：170次
益生菌（如乳桿菌、雙歧桿菌和鏈球菌等）作為有益健康的活菌，其產(chǎn)品質(zhì)量備受關(guān)注。益生菌的主要功效是維護腸道健康，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡等。近期多國研究揭示，市售益生菌產(chǎn)品（包括酸奶）普遍存在益生菌數(shù)量不足、菌種不符等問題，影響消費者的信任與廠商信譽。新加坡理工大學(xué)（SIT）攜手島津新加坡應(yīng)用專家合作開發(fā)出能夠快速、精準檢測益生菌的方案，為益生菌及酸奶產(chǎn)品的微生物含量與種類提供MALDI-TOF快速鑒定方法。本研究中使用的所有益生菌產(chǎn)品都是從新加坡各地的超市購買。
MALDI-TOF MS技術(shù)通過分析微生物獨特的特征性蛋白指紋圖譜實現(xiàn)鑒定。每種微生物在質(zhì)譜儀中都會產(chǎn)生其特有的蛋白峰譜。只需將檢測圖譜與已知物種數(shù)據(jù)庫進行比對，即可實現(xiàn)微生物的快速、準確識別。憑借其操作簡便、速度快的優(yōu)勢，MALDI-TOF MS已成為常規(guī)質(zhì)量控制中替代傳統(tǒng)PCR細菌鑒定方法的優(yōu)選方案。
實驗方法
（一）乳桿菌標準品的培養(yǎng)
選取了四種乳桿菌標準品（嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌）進行培養(yǎng)。購自 Creative Enzymes（美國），均為凍干粉形式。所有四種乳桿菌標準品均通過涂布平板法和平板劃線法進行培養(yǎng)。
圖1a.從左至右：嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌——涂布平板法培養(yǎng)結(jié)果
圖1b.從左至右：嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌——平板劃線培養(yǎng)結(jié)果
（二）挑取菌落的樣品制備
MALDI-TOF 實驗中采用三種方法制備菌落樣本：
1、直接法制備流程：
1) 用無菌接種針從平板劃線培養(yǎng)物中挑取單菌落；
2) 將菌落直接涂布于潔凈的 Fleximass-SR48 鋼質(zhì) MALDI 靶板樣品孔中央；
3) 移取 1 μL 40 mg/mL CHCA 溶液（α-氰基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)）覆蓋樣本；
4) 室溫風(fēng)干。
2、靶上提取法制備流程
1) 用無菌接種針從平板劃線培養(yǎng)物中挑取單菌落，涂布于 Fleximass-SR48 靶板樣品孔中央；
2) 移取 1 μL 乙腈配制的 70% 甲酸溶液覆蓋樣本，室溫風(fēng)干；
3) 移取 1 μL 40 mg/mL CHCA 溶液覆蓋樣本；
4) 室溫風(fēng)干。
3、全提取法制備流程：
1) 用接種環(huán)從平板劃線培養(yǎng)物中取一環(huán)菌體，轉(zhuǎn)移至無菌 1.5 mL 離心管；
2) 加入 300 μL 純水，渦旋振蕩重懸菌體；
3) 加入 900 μL 無水乙醇，渦旋振蕩 1 分鐘；
4) 分裝懸液至新離心管，10,000 rpm 離心 1 分鐘；
5) 棄上清，吸盡殘留液體；
6) 二次離心后徹底吸棄上清，菌體沉淀室溫風(fēng)干 10 分鐘；
7) 加入 20 μL 70% 甲酸，渦旋至沉淀完全重懸；
8) 加入 20 μL 乙腈，混勻；
9) 10,000g 離心 2 分鐘；
10) 取 1 μL 上清液點樣于 Fleximass-SR48 靶板，風(fēng)干；
11) 覆蓋 1 μL 40 mg/mL CHCA 溶液，室溫風(fēng)干。
（三）數(shù)據(jù)采集
由島津AXIMA Performance（MALDI-TOF/TOF）質(zhì)譜儀進行數(shù)據(jù)采集。校準品與樣品均采用每個譜圖累積10次激光激發(fā)，最終譜圖由1000個譜圖的平均值生成。調(diào)節(jié)激光功率，以最大限度地提高峰值分辨率和信噪比。
圖2a. 采用全提取法獲取的嗜酸乳桿菌與干酪乳桿菌MALDI質(zhì)譜圖
圖2b. 采用全提取法獲取的副干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌MALDI質(zhì)譜圖
表1. 基于微生物數(shù)據(jù)庫（BioExplorer，北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司）對四種乳桿菌標準品的鑒定成功率統(tǒng)計
表2. 益生菌產(chǎn)品微生物鑒定結(jié)果與標簽標注菌種的比對
表3. 益生菌/酸奶樣品微生物鑒定結(jié)果及可信度評分（BioExplorer評分＞25）
結(jié)論
本研究證實了MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)在益生菌及酸奶產(chǎn)品快速真?zhèn)舞b別微生物的應(yīng)用潛力。經(jīng)系統(tǒng)驗證，采用全細胞提取法制備菌落樣本可獲得更優(yōu)質(zhì)譜圖譜，從而提升鑒定置信度（BioExplorer）。
島津臺式機MALDI EasyCare系列，榮獲My Green Lab頒發(fā)的ACT環(huán)保標簽認證，踐行我們對可持續(xù)發(fā)展和環(huán)保責(zé)任的承諾。EasyCare功能可輕松進行自我維護，增加實驗室正常運行時間，提高分析效率。其體積小巧，能安裝于各種實驗室。尤其適合有大量樣本分析需求的實驗室，如微生物鑒定、成像分析、生物制藥QC等領(lǐng)域。
參考資料：
會議海報題目《Microbial Identification for Probiotics and Yogurts using
MALDI-TOF Technology》
作者 Tianhua Wang1; Isaac Teh Zhi Xuan2; Chao Sheng Hao2; Naatasha Isahak3
1 Singapore Institute of Technology; 2 Singapore Polytechnic; 3Shimadzu Asia Pacific, Singapore;
本文內(nèi)容非商業(yè)廣告，僅供專業(yè)人士參考。